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Test di clonalità linfoide: alcune domande e risposte per capire di cosa si tratta, come usarlo e come interpretarlo

Cari colleghi, questa settimana cercheremo di fare luce su un un argomento molto "caldo", l'utilizzo della PARR nella diagnosi delle neoplasie linfoidi, e lo faremo con il consueto metodo delle domande più frequenti e relative risposte.

1) Che cosa significa il termine PARR? Il termine sta per PCR for Antigen Receptor Rearrangement. In parole semplici è una PCR che ha lo scopo di amplificare alcune porzioni specifiche del DNA dei linfociti prelevati in un tessuto o in un liquido.

2) Qual è il principio alla base di questa metodica? Il principio su cui si basa è legato alla risposta immunitaria dei linfociti agli antigeni. Sia i linfociti T che i linfociti B presentano dei recettori sulla loro superficie che hanno lo scopo di riconoscere tutti gli antigeni non-self che incontrano. Data la vastità degli antigeni in natura, i linfociti sono predisposti per produrre una quantità enorme di recettori B e T diversi. Per fare ciò “riarrangiano” alcune regioni specifiche del loro DNA che codificano per questi recettori. Il riarrangiamento è in grado di produrre sequenze di DNA numerosissime che codificano per recettori altrettanto numerosi e differenti tra loro, in grado quindi di riconoscere una miriade di antigeni.

3) Quindi la PCR va ad amplificare il DNA di queste porzioni di genoma dei linfociti, ma a quale scopo? Se immaginiamo una risposta infiammatoria a stimoli esterni (es. batterici, virali, allergeni, ecc.), trattandosi di agenti con un corredo antigenico molto variabile e numeroso, ci saranno diversi cloni di linfociti B e T che verranno attivati, ognuno diretto ad un antigene specifico. I diversi cloni produrranno quindi una progenie di linfociti attivati “policlonali”, ovvero con recettori B e T differenti tra loro. Facendo una PCR da una simile popolazione linfocitaria otterremo quindi prodotti di amplificazione di lunghezza e sequenza diversa tra loro (PARR policlonale). Se immaginiamo invece una neoplasia linfoide, che ha preso origine da una singola cellula, la sua progenie presenterà nella situazione più semplice un solo tipo di recettore in superficie e quindi la PARR da tale neoplasia produrrà solo un tipo di prodotto di amplificazione, denominato quindi monoclonale.

4) Quindi in pratica come sfrutto questi concetti? In pratica se sospetto una neoplasia linfoide, una PARR eseguita sul tessuto colpito mi darà un risultato monoclonale, mentre se la lesione non è una neoplasia linfoide ma un processo reattivo, otterrò un risultato policlonale. La PARR può quindi aiutarmi a discriminare tra neoplasia linfoide e una flogosi in molti casi complessi, ove le altre metodiche (es. citologia, istologia, fenotipizzazione) hanno dato risultati dubbi.

5) Allora, se monoclonale è sinonimo di neoplasia e policlonale di popolazione infiammatoria, perché non uso solo la PARR per diagnosticare un linfoma o una leucemia linfoide, senza dover ricorrere a citologia, istologia ecc.? Perchè purtroppo, come per qualsiasi altro test diagnostico, la sensibilità e la specificità non sono assolute. Esistono cioè delle eccezioni alla regola di massima. Ci sono alcune condizioni non neoplastiche che mimano una proliferazione monoclonale tumorale: ad esempio in corso di ehrlichiosi, di reazioni di ipersensibilità o degli infiltrati linfocitari negli istiocitomi in regressione. Viceversa ci sono situzioni in cui di fronte ad una neoplasia linfoproliferativa si ottengono risultati non significativi, per lo più per problematiche tecniche di specificità dei primer utilizzati. Per tale ragione non andrebbe mai usata da sola ma come ausilio diagnostico insieme alle altre procedure più diffuse. Secondo alcuni studi, la specificità della PARR è superiore al 90% ma la sensibilità è ben al di sotto dell'80%.

6) Posso usarla per fare una diagnosi di fenotipo, ovvero sapere se la neoplasia è B o T? Non è la metodica d’elezione, sebbene nella maggior parte dei casi le neoplasie B e T sono clonali per il recettore specifico, ma ci sono eccezioni in particolare per le neoplasie a fenotipo B, che possono risultare clonali per il T-cell Receptor. Per cui per la diagnosi di fenotipo bisogna necessariamente ricorrere a citofluorimetria, immunocitochimica o immuno-istochimica.

7) Ma come procedo in pratica se voglio richiederne una PARR? Semplicemente basta campionare l’organo o il fluido di interesse e inviare il materiale con i seguenti accorgimenti:

  • Fluidi: basta inviarli in una provetta priva di anticoagulanti
  • Campioni citologici: si può eseguire su strisci sia non colorati che già colorati
  • Frammenti bioptici: anche se si può fare su frammento fissato in formalina o addirittura su sezioni già processate per l’istologia, tutti i trattamenti chimici possono dare non pochi problemi tecnici, favorendo risultati falsi (soprattutto negativi). Per cui è consigliabile inviare un frammento prelevato a fresco, mantenuto umido con una garza imbevuta di fisiologica sterile e posto a contatto con alcuni siberini per mantenerlo refrigerato (sarebbe ancora meglio congelato, ma non è facile organizzare un trasporto in ghiaccio secco).

Per chi fosse interessato ad approfondire l’argomento segnaliamo questa recente review:

Keller et al. Clonality testing in veterinary medicine: a review with diagnostic guidelines. Veterinary Pathology; 2016; 53: 711-725

Buona lettura, Walter Bertazzolo

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  • Cara Piera,
    secondo letteratura possiamo avere con la PARR sia falsi positivi sia falsi negativi che ti elenco qua sotto:
    FALSI NEGATIVI:
    1. Numero di cellule neoplastiche inferiore alla quantità minima rilevabile
    2. Riarrangiamenti non riconosciuti dai primers utilizzati
    3. Delezioni nel cromosoma corrispondente (raro)
    4. Origine Natural Killer
    5. Presenza di pro-genitori senza riarrangiamento

    FALSI POSITIVI:
    1. Riaggangiamento clonale in casi di infezioni da E. canis, B. burgdorferi, Bartonella spp. e R. rickettsii
    2. Descritto in ridotto numero di casi di Leucemia Mieloide Acuta
    3. Istiocitoma

    In aggiunta, considera che sensibilità e specificità possono variare in base al tipo di materiale che viene utilizzato (fresco,fissato, citologico e versamento). Da letteratura viene riportato come la specificità PARR nel cane si attesti intorno al 94% e nel gatto intorno 90%. Per quanto riguarda la sensibilità nel cane è intorno ai 70-85% e nel gatto attorno al 65%. Questo dato può' variare tra laboratorio. Per ultimo i dati che ti ho riportato sono per lo più associati a studi su linfomi nodali. Per quanto riguarda le altre sedi sappiamo poco.

  • Sono due cose diverse, nell'articolo è spiegato: l'immuno-fenotipizzazionione ti serve per sapere se la popolazione neoplastica presente è B o T, ma tu già devi avere già una diagnosi di neoplasia. La PARR serve per cercare di capire se sei davvero di fronte ad una neoplasia o ad una flogosi. E' l'obiettivo finale che è differente.
    walter

  • Ospite - Piera

    Quali sono i casi in cui con una PARR posso avere un falso negativo?

  • Ospite - flavia invernizzi

    Ma quali sono le indicazioni per preferire PARR ad immunofenotippizazzione? Grazie. Flavia I.

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