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Test diagnostici

PARR: istruzioni e aggiornamenti per un corretto utilizzo

La PARR è una tecnica molecolare recentemente sviluppata in medicina veterinaria, per la diagnosi di neoplasia linfoide o di condizione reattiva: facciamo il punto della situazione con questo aggiornamento dei nostri esperti.

La diagnosi differenziale tra una malattia linfoide reattiva e neoplastica nel cane e nel gatto può essere complicata in alcuni pazienti e, data la diversa prognosi e trattamento, una diagnosi corretta diventa spesso cruciale. Il test di clonalità (PARR), che valuta la variabilità del riarrangiamento genico dei recettori dell'antigene linfocitario, può essere un valido strumento per integrare l’interpretazione citologica, istologica ed immunoistochimica, allorquando queste non risultino conclusive.

Cerchiamo di fare un po’ di chiarezza sulla metodica e un aggiornamento rispetto ad un nostro precedente post su questo blog.

Che cosa è la PARR?

È una tecnica di biologia molecolare (PCR) attraverso cui si analizzano i riarrangiamenti genici delle cellule linfoidi a livello delle regioni VDJ dei geni delle immunoglobuline (IG) dei linfociti B e del recettore specifico dei linfociti T (T-Cell Receptor).

 

Che cosa è il riarrangiamento delle IG e del TCR?

I geni delle IG e del TCR contengono diversi segmenti genici V, D, e J che vengono riarrangiati in modo casuale durante le fasi inziiali del processo di crescita e differenziazione dei linfociti, conferendo una grande variabilità genetica, al fine di garantire un’elevata capacità da parte dei recettori dei linfociti B e T di riconoscere l’antigeni molto differenti.

 

Perché si chiama PARR?

PARR è l’acronimo di “PCR for antigen receptor rearrangements”.

 

Su quale substrato viene svolta la PARR?

Il test di clonalità si esegue utilizzando il DNA genomico estratto da tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina per l’esame istologico. Inoltre, può essere ottenuto da preparati citologici, anche colorati, e versamenti. Il tessuto fresco o congelato rappresenta un substrato adeguato.

 

I diversi substrati possono influire sul risultato finale della PARR?

Sì. Il DNA genomico estratto dai preparati citologici e dai versamenti è spesso scarso e di bassa qualità. Inoltre, le cellule linfoidi presenti nel campione citologico possono non essere rappresentative dell’intera lesione, causando un errore interpretativo della PARR (soprattutto falsi negativi). In linea generale, non si consiglia di eseguire la PARR su preparati citologici e versamenti, soprattutto senza immunofenotipizzazione. I campioni inviati per l’esame istologico, di solito maggiormente rappresentatavi della lesione, sono invece più adeguati per questo tipo di analisi.

 

A che cosa serve la PARR?

In teoria, permette di distinguere tra processi reattivi/infiammatori a componente linfocitaria (policlonali) e processi neoplastici linfoidi (monoclonali).

 

La PARR è un test definitivo per la diagnosi?

No, per definizione i risultati della PARR (profili di elettroforesi) non sono mai diagnostici o patognomonici di un processo specifico e devono essere sempre interpretati insieme ai dati clinici, morfologici (istologia-citologia) e immunofenotipici (immunoistochimica-citofluorimetria). Pertanto, il solo test di clonalità non è definitivo.

 

Posso utilizzare la PARR per identificare il fenotipo della neoplasia?

No, la PARR non dovrebbe essere considerata come tecnica diagnostica principale per determinare il fenotipo (B o T). Altri strumenti, come la citofluorimetria, l’esame immunoistochimico e l’esame immunocitochimico sono i test indicati per determinare il fenotipo di una neoplasia linfoide. 

 

Quando richiedo la PARR?

Posso richiedere la PARR dopo un’adeguata raccolta di dati clinici-anamnestici, campionamento/i per esame citologico ed istologico ed esame immunoistochimico. Il laboratorio, essendo già in possesso del campione di tessuto in paraffina, potrà eseguire la PARR a seguito della richiesta di aggiunta esame.

 

Quali sono e come interpreto i risultati della PARR?

I profili di elettroforesi sono classificati in diverse categorie rappresentate da schemi archetipici (Figure 1-4):

  • Clonale: solitamente è indicativo di un processo neoplastico. Si rileva un prodotto singolo di amplificazione e di dimensioni attese
  • Policlonale: solitamente è indicativo di un processo reattivo. Si rilevano diversi prodotti di amplificazione di dimensioni differenti.
  • Pseudoclonale: può essere associato ad un processo reattivo o neoplastico. Si rileva un picco clonale non ripetibile in due diversi replicati.
  • Nessun prodotto specifico: può essere associato ad un processo reattivo o neoplastico. Non viene rilevato nessun prodotto di amplificazione.

Figura 1: esempio di amplificato monoclonale delle dimensioni attese.

 

Figura 2: esempio di amplificati policlonali multipli e di piccole dimensioni.

Figura 3: esempio di amplificati monoclonali non ripetibili in due diverse amplificazioni (uno di 137 pb e l'altro di 115 pb).

Figura 4: esempio di amplificato negativo (non si osservano prodotti di amplificazione).

 

Ci sono dei limiti?

Diversi aspetti tecnici e biologici influiscono su sensibilità e specificità della PARR, dando esito a risultati negativi, falsi positivi o formazione di prodotti pseudoclonali. Nelle immagini schematiche seguenti sono elencate le cause principali:

 

 

 

 

Michele Marino, Biologo Molecolare di MYLAV

Luca Aresu, Patologo, consulente di MYLAV

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

 

 

 

 

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