La colorazione citochimica per Fosfatasi Alcalina (ALP) viene utilizzata sempre più spesso nei sospetti di osteosarcoma del cane. Pur essendo un valido ausilio e con notevoli vantaggi pratici, spesso non viene sfruttata adeguatamente. Ecco quindi alcune indicazioni pratiche che vi permetteranno di richiederla ed utilizzarla al meglio, evitando risultati insoddisfacenti.

Colorazione con ALP: innanzi tutto, di cosa si tratta?

E’ una colorazione citochimica piuttosto semplice, eseguibile in pochi minuti, con un colorante specifico che evidenzia il contenuto enzimatico nel citoplasma. Le cellule che contengono al loro interno la ALP, dopo la colorazione diventano più scure, mentre le altre risultano decolorate. Il grande vantaggio della colorazione, oltre al costo ridotto e alla velocità dell’esame, è che DEVE ESSERE ESEGUITA SU PREPARATI GIA’ COLORATI PER L’ESAME CITOLOGICO STANDARD. Questo permette di selezionare prima i campioni da sottoporre alla colorazione citochimica.

Quali cellule risultano positive?

Molte cellule di diversa derivazione contengono al loro interno una certa quota di ALP (ad esempio alcune cellule epiteliali e granulociti neutrofili), ma tra le cellule mesenchimali normali, le uniche che esprimono elevate quantità di ALP nel citoplasma sono gli osteoblasti, ovvero le normali cellule che sono deputate alla produzione della matrice ossea. Da qui nasce il primo punto importante da ricordare: gli osteoblasti normali o reattivi, presenti quindi nell’osso normale o reattivo di nuova deposizione, sono positivi alla ALP. Questo aspetto viene sfruttato nella routine: insieme al campione da analizzare, si utilizza uno striscio da archivio che contenga tali cellule come controllo positivo della reazione, per verificare che sia avvenuta con successo. Ma per la stessa ragione, bisogna fare una considerazione importante, che è il fulcro di tutto il Blog, sottolineata in questo punto successivo:

La colorazione citochimica per ALP non permette di distinguere osteoblasti normali, da osteoblasti iperplastici o neoplastici.

Questo è l’aspetto più importante da considerare. Questa colorazione risulta positiva in tutte le cellule che hanno una derivazione osteoblastica, indipendentemente dal fatto che siano normali/benigne o maligne. Quindi se il vostro dubbio è: “ho un campione osseo e non so se è reattivo o neoplastico”, purtroppo la colorazione ALP non vi risolverà il problema. Anche nell’osso reattivo troverò cellule positive.

Figura 1. A sinistra un osteoblasto normale: con la classica colorazione di routine MGG è una cellula tondeggiante, con citoplasma basofilo e nucleo ovale eccentrico. A destra, due osteoblasti normali dopo colorazione con ALP mostrano granuli nerastri nel citoplasma che li rendono più scuri rispetto alla prima colorazione con normale MGG. Questa è una normale reazione positiva per ALP. 

Quindi quando e come la devo utilizzare?

Per prima cosa è importante eseguire la normale citologia e le indagini radiografiche di base: se la citologia mostra un quadro di osteo-produzione reattiva, è inutile fare anche la ALP. Le cellule nel campione saranno sicuramente positive, ma non avrete la risposta alla vostra domanda: è neoplastico?

Se invece nel campione è francamente presente una popolazione atipica e quindi suggestiva di una neoplasia mesenchimale dell’osso, allora la ALP è indicata perché vi permetterà di confermare che, in caso di positività, quelle cellule neoplastiche hanno una derivazione osteoblastica e quindi siete di fronte ad un osteosarcoma.

Gli altri tumori mesenchimali che possono coinvolgere l’osso (es. condrosarcoma, emangiosarcoma, fibrosarcoma, sarcoma istiocitico) sono invece negativi per ALP, e questo aspetto può essere sfruttato per affinare la diagnosi quando accoppiata alla citologia standard.

Figura 2. FNA da osteosarcoma di cane: a destra sono presenti cellule neoplastiche mesenchimali, che mostrano spesso granulazioni nerastre nel citoplasma, che diventa quindi più scuro rispetto alla prima colorazione con MGG: questo conferma l'origine osteoblastica di tale popolazione cellulare neoplastica. A sinistra si vede invece un normale osteoclasto multinucleato, incluso nella proliferazione neoplastica, che risulta invece negativo (il citoplasma è rimasto azzurro).

Figura 3. Esame citologico da condrosarcoma di cane: le cellule neoplastiche non hanno assunto la colorazione scura tipica di una reazione positiva alla ALP. Insieme all'aspetto radiografico e ai rilievi citologici, questo dato ci conferma che non si tratta di un osteosarcoma ma di un'altra neoplasia mesenchimale.

La colorazione citochimica per ALP funziona solo nel cane?

Sebbene sia stata descritta e validata nel cane, specie nella quale anche Mylav lo consiglia, abbiamo tuttavia effettuato prove interne che ci hanno permesso di verificare che anche nei casi felini sembra funzionare allo stesso modo. La frequenza delle neoplasie ossee del  gatto tuttavia è più bassa rispetto al cane e quindi sono necessari più casi per poter emettere un giudizio più solido.

In conclusione, per un corretto utilizzo:

Step 1 - Hai un sospetto clinico e radiografico di sarcoma osseo - Esegui prima la citologia standard e la biopsia istologica (che andrebbe sempre effettuata per conferma, vista l’importanza e l’impatto delle eventuali terapie successive)

Step 2 - La citologia non ha mostrato un chiaro quadro neoplastico -  La colorazione citochimica ALP non ti aiuterà a dirimere il problema.

Step 3 - La citologia ha mostrato un chiaro quadro neoplastico mesenchimale - La colorazione citochimica ALP ti permetterà di confermare o meno che si tratta di un osteosarcoma.

Walter Bertazzolo, Med. Vet. EBVS European Specialist in Veterinary Clinical Pathology (Dipl. ECVCP); Direttore Scientifico di MYLAV